Análise de microestrutura de moléculas pode salvar vidas

Aplicação na Farmacologia de técnicas emprestadas da Engenharia de Materiais permite explicar e resolver a dificuldade de bioabsorção pelo corpo humano do ativo Efavirenz, utilizado no “coquetel” contra o HIV

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Texto: Valquíria Carnaúba

Em 2013, Silvia Lucia Cuffini recebeu lotes do medicamento genérico Efavirenz (EFV), cuja patente original pertence ao laboratório Merck Sharp & Dohme. O fármaco, administrado no tratamento antiviral de adultos, adolescentes e crianças infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV-1), é fornecido por duas instituições brasileiras que o produzem desde 2007: o Instituto de Tecnologia em Fármacos (Farmanguinhos/Fiocruz) e o Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco Governador Miguel Arraes (Lafepe). Pesquisadora e professora adjunta do Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT/Unifesp) - Campus São José dos Campos, Cuffini percebeu que tinha em mãos um enigma a ser desvendado: dos seis lotes de EFV, aprovados em todos os controles farmacêuticos de rotina da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), um não havia passado no teste de bioequivalência, algo inexplicável de acordo com o conhecimento atual.

Bioequivalência, quando tratamos de medicamentos, significa a capacidade de um genérico exercer em um paciente o mesmo efeito que o original. Essa comprovação é fornecida por meio de testes in vitro e in vivo, cada um com suas particularidades. O estudo in vitro (literalmente, “em vidro”) envolve experiências realizadas fora de qualquer organismo vivo e permite acompanhar um processo bioquímico em ambiente "simplificado". Apesar de muito úteis, estudos in vitro são obviamente limitados, já que em um organismo vivo ocorrem inúmeros outros processos que podem interferir na ação de uma substância. Por isso, nenhuma conclusão pode ser extraída antes dos estudos in vivo (ou seja, realizados em organismos vivos). 

Nessa etapa, alguns lotes do EFV revelaram grande dificuldade de absorção pelo organismo humano, ao contrário do observado nos testes in vitro. “O corpo não espera, possui seu metabolismo, e o caminho natural dos itens que não são absorvidos a tempo é seu descarte pelo organismo”, explica a docente. O princípio ativo do EFV compõe o “coquetel” antiaids, fornecido gratuitamente pelo Sistema Único de Saúde (SUS) desde 1996; integra um combinado de 21 medicamentos que atuam no combate ao HIV, impedindo que o vírus se reproduza e diminua a defesa do paciente. 

Nove desses medicamentos são produzidos no país, entre os quais o EFV, que desde 2007 é sintetizado pelo Farmanguinhos, após licenciamento compulsório autorizado pelo governo federal. Chamado também de “quebra de patente”, o licenciamento compulsório é um mecanismo acionado por órgãos governamentais em casos de interesse público, que autoriza um terceiro a explorar o objeto patenteado sem o consentimento prévio do detentor da patente. O caso do EFV é inédito no Brasil e na América Latina – uma conquista que contribuiu efetivamente para o barateamento do fármaco, que pôde ser produzido em território nacional. 

Quando tomou conhecimento dos fatos, Cuffini descartou fatores como pureza química, tamanho de partículas e polimorfismo (mesma composição e diferentes organizações atômicas). Como atua em Engenharia de Materiais – uma área aparentemente desconectada da Farmacologia –, observou que a microestrutura causa mudanças significativas nas propriedades físico-químicas de alguns materiais. “Essa poderia ser uma possibilidade já que é um ensaio comum na área de materiais metálicos e cerâmicos. Muitas partículas continham moléculas cuja estrutura cristalina lembrava a de cerâmicas, com elevada dureza, resistência a altas temperaturas e grande fragilidade. Pense em um tijolo de cerâmica e no pó que produz: qual deles dissolve mais rápido? Certamente, o pó”, argumenta. Tais discrepâncias moleculares – segundo ela – surgem ainda na síntese da matéria-prima do medicamento. 

Ainda que a baixa solubilidade seja um ponto crítico dos fármacos, a pesquisadora considera que a análise microestrutural permanece restrita à área de Engenharia de Materiais e é pouco praticada pela indústria farmacêutica. Nesse contexto, todos os lotes foram considerados seguros para consumo por não apresentarem, em tese, nenhum problema de fabricação. “Para confirmar minha dedução, tive de recorrer, inclusive, aos especialistas em estudo de microestruturas da Universidade de Trento (Itália) – Luca Rebuffi, Cristy Leonor Azanza Ricardo e Paolo Scardi –, que forneceram os equipamentos necessários para avaliar os lotes de EFV ‘suspeitos’ e que ensinaram como efetuar essa análise.”

Para a docente, a ausência de bioequivalência significa, sobretudo, um risco à vida da população que depende do referido medicamento. Entretanto, a melhora nos controles pode assegurar a reprodutibilidade em sua qualidade. O estudo, realizado em parceria com pesquisadores de várias instituições, rendeu importantes premiações no 9° Encontro Nacional de Inovação em Fármacos e Medicamentos (ENIFarMed/ 2015) e no 3rd International Symposium on Challenges and New Technologies in Drug Discovery & Pharmaceutical Production (Farmanguinhos - Fiocruz/ 2015), além do 1º lugar no Prêmio de Incentivo em Ciência, Tecnologia e Inovação para o SUS/ Categoria - tese de doutorado (Ministério da Saúde/2017).

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Descobrir como a estrutura cristalina de moléculas afeta a solubilidade e o efeito do Efavirenz em pacientes acometidos pela aids rendeu às pesquisadoras Silvia Cuffini (à esq.) e Cinira Fandaruff (à dir.), pertencentes – nessa ordem – à Unifesp e à UFSC, o 1º lugar no Prêmio de Incentivo em Ciência, Tecnologia e Inovação para o SUS (2017), na categoria de tese de doutorado

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Representação da estrutura da molécula de Efavirenz (Imagem: Fvasconcellos / Wikimedia commons)

Caracterização microestrutural

Cuffini apostou em duas formas de caracterização, bastante utilizadas na ciência de materiais, a estrutural e a microestrutural, juntamente com os pesquisadores que colaboraram no estudo: Cinira Fandaruff e Marcos Antônio Segatto Silva, da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC); Danilo Cesar Galindo Bedor e Davi Pereira de Santana, da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); Helvécio Vinícius Antunes Rocha, do Laboratório de Sistemas Farmacêuticos Avançados do Instituto de Tecnologia em Fármacos (Farmanguinhos/ Fiocruz); Luca Rebuffi, Cristy Leonor Azanza Ricardo e Paolo Scardi, da Universidade de Trento (Itália).

Para a análise estrutural, valeram-se de diversas técnicas de foco nas dimensões moleculares, a saber: difração de raios X em pó (XRPD), calorimetria exploratória diferencial (XRPD) e espectroscopia no infravermelho (FTIR). Entretanto, o tamanho médio das partículas de EFV não foi suficiente para explicar os perfis de dissolução (in vitro) ou os resultados de bioequivalência (in vivo) do medicamento. “Todos os seis lotes seriam aprovados com os ensaios convencionais para a análise de matéria-prima antes da produção”, assegura a docente. 

Já a análise microestrutural trouxe respostas mais completas. Para tanto, os pesquisadores apostaram no modelamento total do padrão de difração em pó (em inglês, whole powder pattern modelling), técnica de investigação microestrutural de materiais nanocristalinos que conta com o aporte do software 

PM2K, desenvolvido pela Universidade de Trento, especificamente para utilização em casos similares. Com essa técnica, foi possível detectar os valores médios de tamanho e a distribuição dos domínios cristalinos nas partículas de EFV. “A difração de raios X é sensível ao tamanho dos domínios cristalinos (ou cristalitos), que são as regiões mais cristalinas devido a uma organização das moléculas a longo alcance”, relata Cuffini. 

“A dissolução e a biodisponibilidade de matérias-primas e produtos farmacêuticos têm sido tradicionalmente correlacionadas com várias características físico-químicas, como cristalinidade, polimorfismo, tamanho de partícula, carga de superfície molecular (presença de íons), densidade e porosidade, para citar algumas, fatores ainda desconsiderados por analistas e formuladores farmacêuticos”, acrescenta. A discussão sobre a correlação do tamanho das nanopartículas com a dissolução e a solubilidade é – para ela – muito recente e deve abrir um novo e amplo campo interdisciplinar entre a Engenharia de Materiais e a Farmacologia.

Tamanho de partículas e disposição espacial são coisas bem diferentes...

A pesquisadora Silvia Lucia Cuffini, do ICT/Unifesp, elucida um aspecto importante para a compreensão da ciência de materiais e, por conseguinte, de seu trabalho de análise do Efavirenz. A princípio, é necessário pontuar que os materiais sólidos podem ser classificados de acordo com a regularidade na qual os átomos ou íons se dispõem em relação a seus vizinhos. Caso os átomos estejam ordenados sobre longas distâncias, formando uma estrutura tridimensional chamada rede cristalina, são denominados materiais cristalinos. Normalmente se encaixam nessa categoria os sais, os metais e a maior parte dos minerais. São considerados amorfos (não cristalinos) os materiais em que inexiste ordem de longo alcance na disposição dos átomos. As partículas de todos os materiais cristalinos, inclusive as matérias-primas de insumos farmacêuticos, apresentam uma estrutura cristalina e uma nanoestrutura.

Estrutura cristalina Nanoestrutura
Determina as posições dos átomos, moléculas, íons etc., podendo também ser indicadas as distâncias, os tipos de interação inter e intramolecular e as conformações moleculares Determina o tamanho das áreas cristalinas, denominadas domínios cristalinos ou cristalitos
Medidas utilizadas: escala ångström (Å)
1 Å = 10-10 m
Medidas utilizadas: escala nanométrica (nm)
1 nm = 10-9 m
Material cristalino: aquele no qual os átomos encontram-se ordenados sobre longas distâncias formando uma estrutura tridimensional chamada rede cristalina Material amorfo: aquele cuja estrutura não possui ordenação espacial a longa distância

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FANDARUFF, Cinira; SILVA, Marcos Antônio Segatto; BEDOR, Danilo Cesar Galindo; SANTANA, Davi Pereira de; ROCHA, Helvécio Vinícius Antunes; REBUFFI, Luca; RICARDO, Cristy Leonor Azanza; SCARDI, Paolo; CUFFINI, Silvia Lucia. Correlation between microstructure and bioequivalence in anti-HIV drug Efavirenz. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, [s.l.], v. 91, p. 52-58, abr. 2015. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2015.01.020 >. Acesso em: 29 mar. 2019.

FANDARUFF, Cinira; CHELAZZI, Laura; BRAGA, Dario; CUFFINI, Silvia Lucia; SILVA, M. A. S.; RESENDE, Jackson A. L. C.; DICHIARANTE, Elena; GREPIONI, Fabrizia. Isomorphous salts of anti-HIV Saquinavir Mesylate: exploring the effect of anion-exchange on its solid-state and dissolution properties. Crystal Growth & Design, Washington, DC: ACS Publications, v. 15, n. 11, p. 5.233-5.239, nov. 2015. Disponível em: <https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.cgd.5b00696 >. Acesso em: 29 mar. 2019.

KUMINEK, G.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N.; SIEDLER, S. ; ROCHA, H. V. A.; CUFFINI, S. L.; CARDOSO, S. G. How cocrystals of weakly basic drugs and acidic coformers might modulate solubility and stability. Chemical Communications, [s.l.], v. 52, n. 34, p. 5.832-5.835, mar. 2016. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1039/C6CC00898D >. Acesso em: 29 mar. 2019.