Universidade Federal de São Paulo

Disciplina de Farmacologia
Departamento de Farmacologia

Setor de Modo de Ação de Drogas
Profa. Dra. Soraya S. Smaili

Laboratório de Sinalização e Morte Celular

O nosso laboratório estuda os mecanismos de transporte mitocondrial e mecanismos de sinalização de Ca2+ na sinalização fisiológica e durante a morte celular por apoptose.

Mecanismos mitocondriais e morte celular
I. Participação das proteínas da família Bcl-2.
A apoptose é um tipo de morte celular programada que é verificada em diversas situações fisiológicas bem como em patologias relacionadas com o câncer, doenças neurodegenerativas, infecções e intoxicação, além de patologias cardiovasculares e renais. A apoptose se caracteriza por uma série de alterações morfológicas, pela participação das caspases, liberação de citocromo c mitocondrial e fragmentação nuclear (Kroemer et al, 1998). Nos diferentes processos de morte celular a participação das mitocôndrias é fundamental. Vários estudos têm procurado entender a importância da mitocôndria durante processos de morte celular por outras vias. Estudos mais recentes mostraram que a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), que ocorre devido a abertura do PTP, está presente na morte celular por apoptose (Kroemer et al, 1998; Lemasters et al, 1998). A TPM e o colapso do potencial de membrana mitocondrial (DYm) podem ou não estar envolvidos na liberação do citocromo c (Kluck et al, 1997; Bossy-Wetzel et al, 1998). A apoptose também é controlada pela presença e regulação de proteínas da família da Bcl-2, tais como a Bax e a Bcl-xL. A Bax é uma proteína que promove a morte celular enquanto a Bcl-xL promove a proteção. Durante a apoptose as formas citosólicas da Bax e Bcl-xL se redistribuem e se ligam a membranas, principalmente de mitocôndrias (Hsu et al, 1997; Wolter et al, 1997; Gross et al, 1999). Achados recentes mostram que em sistema que superexpressam a proteína Bax, um colapso do
DYm ocorre minutos antes da inserção da Bax na mitocôndria (Smaili et al, 2001). Por outro lado, a superexpressão da proteína Bcl-xL protege a célula dos efeitos produzidos pela Bax (Hsu e Smaili, 2001). Recentemente a estrutura da Bax e as possíveis mudanças conformacionais foram desvendadas (Susuki et al, 2000) e não se sabe ainda se a Bax se liga à mitocôndria ou se ela produz uma ruptura inespecífica da membrana desta organela. Além disso, não é sabido se, além do citocromo c, a Bax pode liberar o Ca2+ mitocondrial (Ca2+m) (via TPM ou por ruptura) e se este Ca2+, quando liberado maciçamente, pode induzir ou contribuir para a morte celular.

A mitocôndria contribuí também para a sinalização fisiológica do Ca2+ e estudos mostraram que durante as oscilações e ondas de Ca2+ citosólicos, ocorridos devido ao estimulo de receptores metabotrópicos, ocorre a captação e/ou liberação de Ca2+m. Este Ca2+ captado é importante para a mitocôndria pois estimula as desidrogenases mitocondriais e a formação de ATP. A mitocôndria também é capaz de liberar Ca2+ que pode servir para amplificar o Ca2+ no citosol. Nossos estudos têm mostrado que o PTP, em algumas situações, pode abrir transientemente e liberar Ca2+ para o citosol (Smaili et al, 1999; Kowaltowski et al, 2000 e Smaili et al, 2001). Curiosamente, essa atividade do PTP parece estar inibida em células que superexpressam a proteína Bcl-2 atividade diversa (Kowaltowski et al, 2000), mostrando que há uma correlação entre a proteína pro-apoptótica e a homeostase de Ca2+.

II. Disfunção Mitocondrial em doenças neurodegenerativas
A HD é uma desordem neurodegenerativa genética autossômica dominante, no qual o fenótipo é expressado da mesma forma em homozigotos e heterozigotos. Ela é causada por uma expansão da repetição CAG no braço curto do cromossomo 4, e o local exato do gene é um fragmento polimórfico denominado de D4S10 (Gusella et al 1983). Este gene é o responsável pela codificação da proteína huntintina, de 349 Kda, que é expressa largamente no tecido nervoso, nos tecidos periféricos, em vesículas sinápticas e nas mitocôndrias. A HD é considerada uma doença de adultos jovens, uma vez que os sintomas motores iniciam-se por volta de 30-40 anos, apesar de que, em alguns poucos casos, as anormalidades começam um pouco depois do nascimento. Uma vez começada, a HD evolui rapidamente, sendo dividida basicamente em três partes: sintomas motores, desordens psíquicas e um profundo déficit cognitivo. Inserido nesse contexto, o paciente apresenta uma diminuição acentuada na habilidade de elaborar estratégias de mudança de ações, alterações de personalidade, agressividade, depressão e demência, e movimentos motores involuntários, iniciando-se por uma hipercinesia e, evoluindo a uma hipocinesia com uma rigidez motora e uma distonia predominantes. As anormalidades motoras dos pacientes vão aos poucos impedindo com que vivam seu dia-a-dia, causam engasgos freqüentes e perda de peso até evoluírem para a paralização e dependência total.

Medições diretas da atividade da cadeia respiratória mitocondrial no caudado de pacientes com HD demonstraram uma deficiência severa na atividade dos complexos II e III (56%) e no complexo IV (33%) (Gu et al, 1996), mostrando que ela é uma doença do metabolismo mitocondrial. Os defeitos, quer seja na cadeia respiratória quer seja na geração desses radicais, são capazes de diminuir o DYm, o ATP e finalmente fazer com que as células entrem no estágio final da via apoptótica. Não se sabe ainda quais os mecanismos apoptóticos que participam dos processos de desenvolvimento da doença. Como a mitocôndria pode ser central no desenrolar de alguns estímulos que desencadeiam a apoptose e como as alterações mitocondriais são fundamentais no desenvolvimento da HD, um dos nossos objetivos é verificar alterações no transporte mitocondrial e sua relação com a apoptose na HD.

Objetivos principais :
Estudo da participação mitocondrial e do transporte de Ca2+ na apoptose.
Nossos estudos anteriores mostraram que a proteína Bax se movimenta do citosol e se insere nas mitocôndrias e durante este processo ocorre o colapso do DY
m e apoptose. Não estão claros como os mecanismos mitocondriais de transporte de prótons, produção de ROS, síntese de ATP, abertura do PTP, o efluxo maciço de [Ca2+]m para o citosol na resposta apoptótica produzida pela Bax. Desta forma, o objetivo desta parte do trabalho é investigar a influência dos mecanismos de transporte de prótons, a liberação de Ca2+m para o citosol, o consumo de O2 e síntese de ATP induzidos pela Bax. É importante elucidar o envolvimento da TPM neste processo como conseqüência de uma cascata de eventos mitocondriais. Estes estudos utilizam três tipos de modelos celulares, as células de cultura primária de astrócitos, em células de linhagem Cos-7 e PC-12 (para transfecção).

Como a Bcl-2 pode estar influenciando a atividade do PTP e da liberação de Ca2+m para o citosol, em um outro estudo estaremos estudando o papel desta proteína sobre o PTP e a TPM. Investigaremos a influência da Bcl-2 nas respostas de oscilações e ondas de Ca2+ e consequentemente o papel do Ca2+m liberado pelo PTP nestas respostas fisiológicas induzidas pela estimulação metabotrópica. Para isso utilizaremos células de PC-12 que expressam permanentemente a proteína Bcl-2.

A morte celular programada está associada a vários processos de doenças neurodegenerativas. Um dos maiores problemas dos estudos realizados na investigação de disfunções mitocondriais em doenças degenerativas é a utilização de modelos experimentais mais viáveis. O objetivo desse trabalho está sendo investigar tanto o envolvimento da disfunção mitocondrial durante a morte celular, como também estudar os desvios comportamentais em camundongos transgênicos para HD. Vários parâmetros mitocondriais serão estudados incluindo o transporte de Ca2+m, o DYm, o consumo de oxigênio, os níveis de ROS, a produção de ATP de células do SNC e a vitalidade destas células. Além disso, estudos comportamentais serão realizados em diversas fases do crescimento do animal.

Laboratório preparativo

Laboratório de Microscopia de Fluorescência com Câmera Digital de alta resolução

Sala de Cultura


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