Modalidades

Modalidades Disponibilizadas

GEL Bidimensional

                  A separação das proteínas por eletroforese bidimensional  viabiliza os estudos de proteoma. Na etapa de primeira dimensão, as proteínas da amostra são separadas por focalização isoelétrica,  em que ocorre a separação física das proteínas em função dos seus respectivos pontos isoelétricos numa fita de poliacrilamida com gradação contínua  e conhecida de pH (IPG - imobilized pH gradient) submetida a voltagem crescente. Na etapa de segunda dimensão, as proteínas focalizadas são submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) para separação em função de suas massas moleculares específicas. Cada ponto (spot) visualizado no gel pode ser considerado como uma coordenada ortogonal de uma proteína que migrou especificamente em função de seu ponto isoelétrico (eixo x) e sua massa molecular (eixo y). O próximo passo consiste  em corar o gel (com prata, azul de Coomassie, fluorescência , marcação radioativa ou marcadores específicos para fosfoproteínas, glicoproteínas, etc) para visualizar o padrão de expressão protéico e fotodocumentar o gel com o densitômetro. Posteriormente, procede-se o corte e digestão dos spots selecionados do gel (pode-se utilizar o Xcise) e, por fim, realiza-se a identificação das proteínas de interesse  a partir do espectômetro de massas  integrado a uma ferramenta bioinformática, como o Mascot (http://www.matrixscience.com).
              Os géis de eletroforese bidimensional refletem o padrão de expressão protéico da amostra biológica analisada e permitem detectar, graças à mudança de posição do spot, a variação de até mesmo um único aminoácido entre duas isoformas ou modificações covalentes na mesma proteína (e.g. proteínas transdutoras de sinal que sofrem fosforilação).  Assim sendo, enquanto o genoma representa as proteínas potencialmente expressas, o proteoma representa o perfil realmente expresso de um genoma em uma determinada condição ou momento metabólico. Por outro lado, três das questões mais críticas de uma análise proteômica são: a) a solubilização do conjunto de proteínas obtido desde os procedimentos iniciais de extração até a transferência dos IPGs para os géis de SDS-PAGE da segunda dimensão; b) dificuldade/ impossibilidade de detectar proteínas expressas com baixo número de cópias no sistema analisado (Haynes & Yates 2000) e c) baixa resolução na separação de de proteínas de pI extremamente alcalinos ou ácidos e de proteínas muito grandes (MM > 100.000 Da).   Adicionalmente, deve ser levado em consideração que existem parâmetros para a validação de uma análise proteômica que incluem, principalmente, a reprodutibilidade do perfil obtido nas replicatas biológicas.

                Salienta-se que cada amostra, dependendo de sua natureza, requer um tipo específico de processamento para extração e focalização. Neste sentido, é esperado que o usuário verifique previamente em publicações relacionadas quais os protocolos e metodologias que melhor se adequam às suas necessidades experimentais. Adicionalmente, os aparelhos de primeira e segunda dimensão de eletroforese foram adquiridos da empresa Bio-Rad (http://www.bio-rad.com).

Xcise

                  O Xcise é um processador automático de géis que permite excisão precisa dos spots do gel 2-D e acompanha um software  específico (Progenesis) dotado de ferramentas de análise  as quais otimizam a quantidade de informações obtidas a partir da proteína extraída do gel 2-D. É um instrumento que precede a inserção das amostras no MALDI  e foi projetado para previnir a contaminação interamostral, posto que realiza com maximizada segurança as etapas de excisão à digestão dos spots.

           O Xcise é um robô que, especificamente, realiza de modo integrado extração, digestão e tripsinização dos spots selecionados. Além disso, o Xcise é acoplado ao Accuspot, que automaticamente dispõe as amostras na placa para serem levadas ao MALDI.

MALDI-TOF

                 O Laboratório de Proteômica da UNIFESP possui um espectrômetro de massas  MALDI ToF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – ionização/ dessorção a laser assistida por matriz - Karas e Hillekamp 1998), apropriado para análise de biomoléculas com elevada massa molecular, como proteínas e peptídeos. Antes de serem levadas ao analisador de massas, as proteínas são submetidas a digestão com uma endoproteinase (e.g. tripsina). Os peptídeos resultantes da digestão são pipetados junto de uma matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmico ou ácido sinapínico são as mais comumente utilizadas) para co-precipitarem na placa a ser inserida no aparelho. Quando o laser do espectrômetro de massas incide sobre a mistura co-precipitada matriz e amostra, a matriz, que possui a propriedade de ionizar facilmente, protona os peptídeos da amostra ([MH+] + A => M + [AH+]) e faz com que as espécies ionizadas sofram dessorção (passagem do estado sólido para o gasoso). A seguir, os peptídeos são submetidos a um campo elétrico e somente aqueles que foram protonados por interação com a matriz serão acelerados. Sabendo-se que o tempo de vôo (Time of Flight – ToF) de um íon em um tubo livre de forças é proporcional à relação massa/carga (m/z) da molécula, os íons carregados são liberados num tubo sob vácuo no qual é mensurado, para uma dada voltagem e aceleração, o “tempo de vôo” que o peptídeo leva para alcançar o detector. A intensidade do sinal elétrico em função da razão m/z é detectada por um processador de dados o qual gera o espectro correspondente (Gross 2004) e esta medida deconvoluída e representada num pico de massa/carga de MS (Mass Spectrometry) se comunica com um banco de dados para a identificação da composição elementar da molécula ionizada (no caso da sequência do peptídeo analisado). A ferramenta de bioinformática infere ainda um intervalo de confiança para o resultado fornecido. Neste contexto, a possibilidade de identificação da proteína de interesse é influenciada pelo processamento, pela qualidade e quantidade de proteína presente na amostra, pelo nível e tipo de possíveis modificações pós-traducionais, pela estringência da busca e, de maneira especial, se a sequência do peptídeo procurado já se encontra depositada no banco de dados da busca (Kopke 2003).

Sobre a relação entre o tempo em que um peptídeo leva para percorrer a distância do tubo de vôo e sua massa/ carga, tem-se que:   

 Assim sendo, o tempo de vôo de um peptídeo está relacionado à relação massa/carga deste peptídeo, sendo que os peptídeos de maior massa levarão maior tempo para atingir o detector. O espectrômetro de massas da Plataforma de Proteômica da UNIFESP foi adquirido da empresa Shimadzu (www.shimadzu.com.br ) e, como mencionado ao longo do texto, trata-se de um MALDI MS - como vantagem, o MALDI apresenta nível de ionização leve ("soft"), que permite que biomoléculas com até milhões de Daltons sejam reportadas intactas, já que os íons formados possuirão baixa energia interna e tendem, por isso, a chegarem ao detector sem sofrer fragmentações acidentais.  Adicionalmente, o MALDI-TOF tem alta sensibilidade (500 fM),  permite rápida aquisição de dados, possui boa acurácia para mensurar massas (0,5 Da de erro), apresenta custo de manutenção relativamente baixo e os dados gerados são de simples interpretação.  

Laboratório de Proteômica

Rua Pedro de Toledo, 781, 4o andar - frente, Vila Clementino - São Paulo (SP)

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