Laboratório de Controle Genético
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Coordenação: Profa. Dra. Clélia Rejane A. Bertoncini
Colaboração: Gui Mi Ko e Profa. Dra. Marimélia Porcionatto
Auxílio Técnico: Darci Souza Marinho
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No ano de 2000, o Laboratório de Controle Genético do CEDEME foi implementado com recursos de um Projeto multiusuários FAPESP, do qual participaram os Professores Aron Jurkiewicz, João Bosco Pesquero, Luiz Edmundo de Magalhães e Clélia R. A. Bertoncini, além das funcionárias Gui Mi Ko e Heloisa Allegro Baptista. Em 2002, somando recursos adicionais de projetos de outros pesquisadores, como a Profa. Eliane Beraldi Ribeiro e a Profa. Soraya S Smaili, realizavam-se aproximadamente 100 análises de controle genético ao mês e contemplava-se 5 pesquisadores, todos da UNIFESP. Conforme ilustra a Tabela 1 estavam estabelecidos os métodos de genotipagem de 6 linhagens distintas, entre mutantes e transgênicos. As linhagens transgênicas consitiam de camundongos que expressam o receptor adrenérgico alfa-1B (Tg-alfa-Adra1B), modelo da doença de Huntington (B6CBA-TgN (HDExon1)R6/1), do camundongo nocaute no receptor adrenérgico alfa 2A (Adra2A-KO) e ainda dos camundongos nocautes em óxido nítrico sintase neuronal e endotelial, denominadas de NOS1-KO e NOS 3-KO, respectivamente. Também tinha sido estabelecido o protocolo de identificação de uma colônia de ratos mutada no receptor de leptina, que são modelos de obesidade e diabetes, denominados de ratos fa/fa (‘fat’ homozigotos) e fa/+ (‘fat’ heterozigotos). Como os animais obesos fa/fa não conseguem copular, foi a identificação dos ratos Zucker heterozigotos (fa/+) e o acasalamento entre eles que permite a manutenção da colônia e o seu uso na pesquisa (Iuras et al., 2005), além de possibilitar o atendimento à crescente demanda por esta linhagem.
A genotipagem da colônia de camundongos transgênicos pela superexpressão de huntintina humana mutada (B6CBA-TgN (HDExon1)R6/1) ilustra a importância do controle genético, especialmente quando um estudo requer que cada animal utilizado seja genotipado antes que apresente  o fenótipo esperado. Como os sintomas neurológicos da Coréia de Huntington somente após 8 meses de idade no camundongo transgênico, então a genotipagem precoce de cada animal permitiu correlacionar alterações de parâmetros bioquímicos, como a morte neuronal, com o envelhecimento (Teles et al., 2008; Rosenstock et al., 2008).
A Tabela 1 também apresentada novas linhagens, que foram importadas mais recentemente. Conforme especificado nesta Tabela, as novas linhagens constituem-se de camundongo obeso (ob/ob), rato transgênico GFP (que expressam a ‘green fluorescent protein’) derivado de rato Sprague-Dawley (SD-Tg(GFP)2Bal), camundongo transgênico modelo de Alzheimer (Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo) e camundongo nocaute KO-VAChT – deficiente no transportador de acetilcolina vesicular.
Algumas linhagens de nocautes ou knok-in vêm sendo genotipadas a cada seis meses (como os dois modelos nocautes NOS-KO e ADRA2B-KO), pois se tratam de colônias de animais homozigotos (que contém o gene inativado nos dois alelos) e, a menos qua aja um cruzamento acidental com um animal de outra linhagem, permanecem geneticamente modificadas e estáveis em relação à sua colônia de fundação original. Assim, o controle genético semestral permite que estas linhagens sejam mantidas, amplificando-se cada uma das colônias específicas, conforme a demanda.
Atualmente, atendemos a uma demanda de aproximadamente 250 análises ao mês para mais de 30 pesquisadores, incluindo vários pesquisadores de outras Universidades brasileiras.

Genotipagem por PCR

No geral, a metodologia de genotipagem segue várias etapas comuns às diversas linhagens, desde a coleta do tecido animal até a obtenção de imagens como aquelas apresentadas nas Figuras 1 a 3. A genotipagem dos neonatos pode ser feito a partir de uma pequena quantidade de tecido, em geral proveniente da ponta da cauda ou de um furo na orelha. Cada biópsia pode ser congelada a -20 0C durante alguns dias, mas deve ser processada tão logo quanto possível para a extração do DNA antes que ocorra a sua degradação. Em geral a solução de extração do DNA contém um detergente, alguns sais, e as enzimas Proteinase K e Ribonuclease A. Para as linhagens de animais transgênicos por adição (Tg) e nocautes (KO), a detecção do transgene no genoma dos filhotes é realizada pela técnica de PCR (“Polimerase Chain Reaction”), embora a metodologia de Southern blot (hibridização com sonda de DNA contendo fósforo radioativo) também possa ser usada. Para a reação de PCR, necessita-se de uma enzima de síntese de DNA resistente à alta temperatura (Taq polimerase) e de dois a cinco pequenos oligonucleotídeos específicos para cada modelo animal. Estes oligonucleotideos são mais conhecidos como “primers”, pois se anelam ao DNA complementar para dar início à amplificação de várias cópias de DNA. Assim, os produtos de PCR apresentam tamanhos diferentes, conforme os primers encontrem como molde o transgene ou apenas o DNA do animal selvagem. A separação dos produtos de PCR é realizada por eletroforese em um gel de agarose corado com brometo de etídeo. A imagem do gel é fotografada sob luz ultravioleta. Conforme o êxito do procedimento, aparece no gel uma banda de migração do transgene, geralmente mais próxima ao topo do gel, porque o construto de DNA freqüentemente apresenta maior peso molecular do que o gene original sozinho (Figuras 2 e 3). Quando “primers” para o gene não alterado são adicionados à reação de PCR, aparece também uma banda de menor tamanho como o resultado da amplificação uma região do gene intacto, ou seja, a banda que indica ser a amostra proveniente um animal selvagem ou heterozigoto. Nessas condições, a detecção uma única banda do tamanho esperado para a presença do transgene identifica um animal transgênico homozigoto.
As Figuras 1 a 3 ilustram análises de controle genético recentes, exemplificando cada um dos modelos de modificação genética 1, que podem ser um animal mutante (Figura 1), transgênico por adição (Figura 2) ou nocaute (Figura 3). A genotipagem dos camundongos Alzheimer seguiu o protocolos recomendado pelo fornecedor( http://jaxmice.jax.org/strain/005864.html )com base na literatura relacionada (Jankowsky et al., 2004), apenas modificando-se a temperatura de anelamento dos primers para 56 0C. Já os camundongos (ob/ob), que apresentam uma mutação localizada cromossomo responsável pela deficiência em leptina, são genotipados conforme descrito na literatura (Friedman et al, 1991) utilizando-se um protocolo semelhante ao descrito para o rato Zucker (Figura 1), porém neste caso a enzima de restrição que corta o gene mutado é a Dde 1. Os camundongos ob/ob desenvolvem uma síndrome caracterizada por hiperfagia, diabetes e obesidade, constituindo-se num dos modelos de estudo grande interesse por diversos pesquisadores da UNIFESP.
A genotipagem da colônia de ratos Sprague-Dawley transgênicos que expressam a “green fluorescent protein” (SD-Tg(GFP)2BalRrrc) também foi recentemente estabelecida em nosso laboratório de Controle Genético (Figura 2).Esta linhagem é muito usada como fonte de células marcadas para transplante, mas ao contrário dos camundongos GFP “verdes” não podem ser reconhecidos a olho nu, visto que não expressam a proteina bioluminescente na pele, e sim em órgãos internos (Mothe et al., 2005). Então, é a genotipagem por PCR que nos permite distinguir animais selvagens de transgênicos heterozigotos e homozigotos e assim garantir a continuidade da colônia. Para isso, adaptamos protocolos previamente descritos (Lois et al., 2004; Mothe et al., 2005) e apresentados no site http://www.nrrrc.missouri.edu/StrainInfo.asp?appn=65. Como na maioria dos casos, a adaptação implicou em mudança na temperatura e no tempo de anelamento dos “pimers”, pré-determinados no programa a ser executado pelo termociclador.
A necessidade de modificações nos protocolos de PCR, em relação ao recomendado pelo fornecedor, pode ser conseqüência do contínuo aperfeiçoamento de equipamentos e kits de reagentes, cada vez mais sensíveis a menores quantidades de DNA e menos insensíveis a presença de impurezas.

Tabela 1 - Genotipagem de mutantes, transgênicos (Tg) e nocautes (KO).

* Ver referências completas e sites relacionados na última página.

Figura 1 – Genotipagem dos ratos Zucker - O produto inicial da reação de PCR apresenta uma banda de 1800 bp amplificada pelos primers sense: 5' GTT TGC GTA TGG AAG TCA CAG 3' e antisense 5' ACC AGC AGA GAT GTA TCC GAG 3', que não aparece nesta imagem de gel de agarose 1 %. No gene selvagem, existe apenas um sítio de restrição para a Msp1, formando-se um fragmento de 1100 bp. No mutado, ocorre uma clivagem deste fragmento, fornecendo um fragmento adicional de 950 bp. A mutação produz um receptor de leptina defeituoso, causa da obesidade em homozigotos (fa/fa) e também de esterelidade nas fêmeas (fa/fa). O cruzamento entre heterozigotos (fa/+) permite a manutenção da colônia Zucker. Este protocolo de genotipagem foi adaptado a partir de metodologias previamente estabelecidas (Phillips et al., 1996; Takaya et al., 1996), utilizando-se o seguinte programa de PCR:1) 94 oC por 5 min; 2) 32 ciclos de a) desnaturação a 92 0C por 45 seg; b) anelamento dos primers a 54 0C por 1 min e c) extensão a 68 0C 5 min; 3) Extensão final e estabilização do produto de 1800pb 72 0C 10 min. Cada reação continha 100-200 ng de DNA e os seguintes reagentes:1,5 mM de cloreto de magnésio, 200 mM de dNTPs, 100 ng de cada primer, 1,25 U de Taq DNA Polimerase (Master Mix, Eppendorf) e água para um volume final de 50 mL. A digestão do produto de 1800 pb é feita em solução contendo 14 mL de DNA, 2 mLda enzima de restrição Msp1 (10 U/ ml) num volume final de 25mL. PM = peso molecular. pb = pares de base.

Figura 2 – Genotipagem dos ratos transgênicos (SD-Tg(GFP)2Bal) – linhagem de ratos Sprague Dawley que expressa GFP (“green fluorescent protein”). As bandas nesta imagem do gel correspondem aos produtos da reação de PCR, utilizando-se “primers” descritos na literatura (Lois et al.,2004; Mothe et al., 2005). A genotipagem permite distinguir animais selvagens de transgênicos homozigotos e heterozigotos. O programa para o termocicador incluiu 35 ciclos de três etapas: (a) desnaturação a 94 0C por 1 min, (b) anelamento a 56 0C por 50 segundos e (c) extensão a 72 0C por dois minutos. A extensão final durou 5 minutos a 72 0C. PM = peso molecular. pb = pares de base.

Figura 3 – Genotipagem de camundongos nocautes KO – VachT - A imagem ilustra os seguintes resultados: Camundongo selvagem (+/+): banda de 336 pb (amplificada com os primers VAT2DETASB e VAT2DET2S); Camundongo heterozigoto(+/-): 2 bandas, uma de 336 pb (amplificada  com os primers VAT2DETASB e VAT2DET2S) e uma de 528 pb (amplificada com os  primers VAT2DET2S e VATDET1AS); Camundongo nocaute homozigoto (-/-): uma banda  de 528pb. O Programa do PCR obedeceu às seguintes etapas:1) 94 oC por 3 min; 2) desnaturação do DNA a 93 oC por 30 seg;  3) anelamento dos primers a 54  oC por 45 seg; 4) extensão do SNA 72 oC por 1 min; 5) amplificação de cópias dos produtos de PCR por repetição de 34 ciclos dos passos 2-4; 6)  60 oC por 1 min; 7) 72 oC por 5 min; 8) 4 oC “for ever”. Sequências dos primers:VAt 2DET 2S: 5´ tca tag ccc caa gtg gag gga ga 3´; VAT 2DETASB: 5´ ggt tca tat ccc cga gct cag gag 3´; VATDET 1AS: 5´ gga act tcc tga cta ggg gag gag 3´. Ladder = peso molecular em escala de 100 pb; pb = pares de base.

Controle Genético de Animais Convencionais

As colônias de camundongos das linhagens C57Bl/6J e BALB/cJ, adquiridas do Laboratório Jackson em fevereiro de 2006, foram recentemente submetidas à análises de controle genético. Para estas análises, o DNA foi isolado do tecido de uma biópsia da ponta da cauda de animais destas colônias de Fundação e de estoques escolhidos aleatoriamente entre as salas de criação do CEDEME. O DNA foi submetido a análises de PCR (‘Polymerase Chain Reaction’) utilizando-se kits de PCR Master Mix (Promega) e os primers de DNA correspondentes  aos microsatélites especificados na Tabela 2, que contemplam sequências presentes nos 19 cromossomos autossômicos. Como resultado, verificou-se que os camundongos de ambas as linhagens continham as sequências de DNA esperadas, o que foi visto após eletroforese em gel de agarose 3% e captura da imagem sob luz UV. A presença destas sequências foi detectada como produtos de PCR dos tamanhos indicados na tabela 3 para cada par de ‘primers’. Isto indica  que nossas colônias mantêm-se geneticamente estáveis e constituem-se de animais isogênicos com aqueles do Laboratório Jackson desde a sua importação até o presente.
Portanto, do ponto de vista genético, os camundongos C57Bl/6 e BALB/c do CEDEME exibem as características desejáveis para a confiabilidade e a comparação de resultados de pesquisas atuais com aquelas realizadas com as mesmas linhagens em períodos anteriores, mesmo em outros laboratórios fora do Brasil.

Tabela 2 – Microssatélites para genotipagem de camundongos C57Bl/6 e BALB/c

* As iniciais D1 até D19 indicam DNA seguido do número do cromossomo onde se encontra a seqüência de primers de cada microssatélite, conforme designação do Mit (“Massachussets Institute of Technology”). Pb = pares de bases. As informações referentes a cada marcador foram acessadas, caso a caso, a partir do site: http://www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch?page=markerQF

Referências:

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Iuras, A.; Telles, M.M.; Bertoncini, C. R. A.; Ko, G. M.; Andrade I. S.;Silveira, V. L. F.; Ribeiro, E. B. Central administration of a nitric oxide precursor abolishes both the hypothalamic serotonin release and the hypophagia induced by interleukin - 1b in obese Zucker rats. Regulatory Peptides, 124: 145-150, 2005.
Jankowsky, J. L.; Fadale, D. J.; Anderson, J.; Xu, G. M.; Gonzales, V.; Jenkins, N. A.; Copeland, N. G.; Lee, M. K.; Younkin, L. H.; Wagner, S. L.; Younkin, S. G.; Borchelt, D. R. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Hum. Mol. Genet. 13: 159-70, 2004. http://jaxmice.jax.org/strain/005864.html
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Mothe, A. J.; Kulbatski, I.; Bendegem, R. L.; Lee, L.; Kobayashi, E.; Keating, A.; Tator, C. H. Analysis of green fluorescent protein expression in transgenic rats for tracking transplanted neural stem/progenitor cells. J. Histochem. Cytochem., 53: 1215-1226, 2005. http://www.nrrrc.missouri.edu/StrainInfo.asp?appn=65
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Takaya, K.; Ogawa, Y.; Isse, N.; Okazaki, T.; Satoh, N.; Masuzaki, H.; Mori, K.; Tamura, N.; Hosoda, K.; Nakao, K. Molecular cloning of rat leptin receptor isoform complementary DNAs - Identification of a missense mutation in Zucker fatty (fa/fa) rats. Biochem. Biophys Res. Commun. 225: 75-83, 1996.

Clélia R. A. Bertoncini – Julho de 2008.
clelia.cedeme@epm.br
http://www.unifesp.br/centros/cedeme/lab_gene.htm